%20%E0%B8%AB%E0%B8%A3%E0%B8%B7%E0%B8%AD%E0%B9%83%E0%B8%8A%E0%B9%89%E0%B9%83%E0%B8%99%E0%B8%81%E0%B8%A3%E0%B8%93%E0%B8%B5%E0%B8%97%E0%B8%B5%E0%B9%88%20DNA%20template%20%E0%B8%A1%E0%B8%B5%20%GC%20%E0%B8%AA%E0%B8%B9%E0%B8%87){kind=link}
บทความโดย คุณอุทัยพร สิงห์คำอินทร์
QIAGEN LongRange PCR Kit : เหมาะสำหรับการทำ PCR ที่ target size มีขนาดยาวมากๆ (มากถึง 40 kb ซึ่ง PCR ปกติที่ใช้ Taq DNA polymerase จะได้ความยาวไม่เกิน 5 kb) หรือใช้ในกรณีที่ DNA template มี %GC สูง
– ขนาดชุด kit มีตั้งแต่ 20, 100, และ 25o reactions (20 kit ราคา 5,050 บาท (ไม่รวม vat) ค่อนข้างแพงมาก 250 บาท/test)
– ส่วนประกอบของชุด kit
- LongRange PCR Enzyme Mix : เป็นตัวที่สำคัญ และให้มาอย่างพอเพียงมาก (8 ul สำหรับ 20 reactions ซึ่งต้องใช้ 0.4 ul/reaction คำนวณดูแล้ว ห้ามทำหก!!! ห้ามดูดเกินเด็ดขาด!!!) ในรายละเอียดไม่ได้บอกไว้ว่าเป็นเอนไซม์ชื่ออะไร บอกแต่ว่าเป็น highly pure recombinant thermostable DNA และมีคุณสมบัติต่อไปนี้ด้วย 5′-3′ exonuclease activity, 3′-5′ exonuclease activity (proofreading ซึ่งไม่มีใน Taq) และ terminal transferase activity(การเติม PolyA tail จึงสามารถนำไปทำ TA/UA cloning ต่อได้ทันที)
- LongRange PCR Buffer : เป็น buffer ที่เติม Mg มาพร้อมแล้ว
- Q-Solution : เป็น PCR additive (แต่ไม่ใช่ DMSO) จะช่วยทำให้การ DNA template melting ได้ดีขึ้น
- dNTP mix
- RNase-free water
- denaturation อุณหภูมิและเวลาที่ใช้ จะเหมือนๆ PCR ปกติ
- annealing อุณหภูมิที่ใช้ขึ้นอยู่กับ primer ของเรา
- extension ใช้อุณหภูมิ 68 C ซึ่งเหมาะสมกับ LongRange PCR Enzyme แต่ระยะเวลาและขั้นตอนจะต่างกัน โดย Very Long-Range PCR จะเพิ่มระยะเวลา 2o วินาที ในรอบถัดๆไป ของการทำ PCR
- LongRange PCR Buffer 2.5 ul
- dNTP mix 1.25 ul
- Forward primer 0.5 ul
- Reverse primer 0.5 ul
- RNase-free water 18.05 ul
- LongRange PCR Enzyme Mix 0.2 ul
- DNA template 2 ul
PCR condition : เนื่องจากไม่ทราบขนาดของ PCR product และ genomic island มักจะมีขนาดใหญ่มากว่า 10 kb จึงเลือก condition สำหรับ Very Long-Range PCR
- Initial activation step 93 C 3 min
First 10 cycles :
- Denaturation 93 C 15 sec
- Annealing 54 C 45 sec
- Extension 68 C 10 min
- Denaturation 93 C 15 sec
- Annealing 54 C 45 sec
- Extension 68 C 10 min + 20 sec in each additional cycle
- Hold 4 C
ผลที่ได้จริงจากที่ลองทำ
lane1,2 : marker
lane3,4 : sample
สรุปตามความคิดเห็นส่วนตัว
– kit นี้ใช้ง่าย สะดวก ผลที่ได้สวยงาม โอเคเลยทีเดียว
– ราคาแพงไปนิด แต่สำหรับแลบที่รวยๆ ทุนเยอะ คงไม่มีปัญหา(รึเปล่า)
– สั่งซื้อกับบริษัท Bioactive ซึ่งเป็นตัวแทนจำหน่าย QIAGEN แนะนำให้สั่งล่วงหน้าก่อนใช้งานจริงสัก 1-2 เดือน เพราะต้องรอของนาน ยิ่งตอนนั้นที่สั่่งเป็นช่วงน้ำท่วม รอนานมากกว่าสามเดือนเลยทีเดียว
– ไม่ได้มีแค่ QIAGEN ยี่ห้อเดียว มีของ invitrogen ด้วย แต่เค้าจะแยก Kit ตามขนาด PCR product ซึ่งถ้าเป็นกรณีของเราที่ไม่ทราบขนาดของ PCR product ก็เลยเลือกไม่ถูก จึงตัดสินใจใช้ QIAGEN
เผยแพร่ครั้งแรกที่ https://noobnim.in.th/review-qiagen-longrange-pcr-kit/
ขออณุญาติฝากลิ๊งค์ของตัวแทนจำหน่ายQiagenครับ http://www.primasci.com